做膜蛋白、线粒体复合物或蛋白互作研究时，你是不是常被这两个问题卡住：
• 碱性蛋白怎么跑都不动
• 膜蛋白一上样就聚集
普通 SDS-PAGE 早已不够用。今天我们就来聊聊专为天然蛋白复合物设计的“专属分离神器”——Blue Native PAGE（BN-PAGE）。从原理到应用，从转膜避坑到案例对比，一篇帮你理清。
BN-PAGE（蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种在天然状态下分离蛋白质复合物的核心技术。
它适用于质膜、胞浆、线粒体、组织匀浆等多种生物样品，分离分子量范围可达 10 kDa ~ 10 MDa。
传统 SDS-PAGE 依靠 SDS 使蛋白变性并带上负电荷。
而 BN-PAGE 用 考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS：
• G-250 与蛋白质结合，赋予其负电荷，使其在电场中向阳极迁移。
• 蛋白保持天然构象，分离差异来源于有效电荷、分子形状和分子量大小。
解决碱性蛋白跑胶难题
等电点（pI）偏高的蛋白通常带正电，G-250 将它们转换为带负电，从而统一向阳极迁移。
减少膜蛋白聚集
G-250 能非特异性地结合到蛋白的疏水区域，将其转变为带负电的位点，显著降低膜蛋白或疏水蛋白的聚集风险。
一步分离蛋白复合物
直接从生物膜、全细胞裂解液或组织匀浆中分离出天然状态的蛋白复合物，无需提前纯化，省时省力。
测定分子量与寡聚状态
通过对比已知分子量的非变性 marker，可以估算目标蛋白复合物的分子量，并判断它是单体、二聚体还是更高阶的寡聚体。
识别生理性蛋白-蛋白相互作用
在非变性条件下，弱而真实的相互作用得以保留，因此可用于验证两个蛋白是否在细胞内天然结合，或筛选互作伙伴。
• 转膜方式：优先推荐湿转法
• 膜的选择：
✅ 只用 PVDF 膜
❌ 禁用 NC 膜（硝酸纤维素膜）
原因：NC 膜会与 G-250 发生不可逆结合，染料无法彻底清除，严重影响后续检测。
研究线粒体呼吸链复合物时，需要保留蛋白的天然活性和结构完整性，以便进行后续功能分析。这里自然引出两种常见的非变性电泳方法——BN-PAGE 与 CN-PAGE 的选择问题。
Wittig 和 Schägger 的研究以大鼠心脏线粒体为样本，对比了 BN-PAGE 和 CN-PAGE 对呼吸链复合物的分离效果。结果发现：
• BN-PAGE 能够清晰分离出呼吸链复合物 I、III、IV 以及 ATP 合酶（复合物 V），分辨率高，适合常规的复合物组成和寡聚状态分析。
• CN-PAGE 则额外检测到了 BN-PAGE 条件下容易解离的超分子组装体，例如 ATP 合酶的二聚体和更高阶寡聚体。这些超组装体在线粒体嵴结构形成和能量代谢中具有重要功能。
▲ Fig. 1 Two-dimensional native resolution of rat heart mitochondrial complexes
▲ Fig. 2 3-D SDS-PAGE identifying the constituent proteins of supercomplexes.
如果你的目标是快速、稳定地分析已知复合物的分子量或亚基组成，BN-PAGE 是首选。
如果你怀疑目标蛋白复合物结合较弱，或者想探索是否存在更高级的超分子组装体，建议同时尝试 CN-PAGE 作为补充，以免遗漏关键信息。
[1]Wittig I, Schägger H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 2005 Nov;5(17):4338-46. doi: 10.1002/pmic.200500081. PMID: 16220535.
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