实验指南 | 蛋白样品制备3——蛋白定量完全指南

蛋白定量本质上是通过特定化学反应将蛋白含量转化为可测量信号的过程。目前主流方法分为两大技术路线：

1.1 BCA法：铜离子还原的“变色龙”

BCA法是一种基于铜离子还原的检测方法。其原理分为两个关键步骤：

第一步：在碱性环境下，蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺。这个反应主要由蛋白质中的肽键以及半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸等特定氨基酸残基驱动。

第二步：生成的Cu⁺与两分子BCA试剂螯合，形成在562nm处有最大吸收峰的紫色络合物。简单来说，就是“蛋白还原铜离子，BCA捕获显紫色”。颜色的深浅与蛋白浓度成正比。

1.2 Bradford法：染料结合的“变形计”

Bradford法则基于考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质的结合特性。在酸性条件下，染料原本是红棕色形式，最大吸收峰在465nm处。

当与蛋白质结合后，染料转变为蓝色形式，最大吸收峰变为595nm。这一颜色变化直接反映了蛋白质的浓度。

因染料主要与蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合，且两者在各种蛋白质含量不同，故用于不同蛋白质测定时有较大偏差，另外范德华力和疏水作用也会影响蛋白与染料的结合。

Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K⁺、Na⁺、Mg²⁺离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP和β-巯基乙醇等。但需要注意的是：由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween20、Tween60、Tween80低于0.06％。

特别注意：检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250；G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。

2.1 试剂盒关键特性对比

面对不同的实验样本和条件，该如何做出明智选择呢？下表总结了两种方法的关键特性对比：

2.2 评估样品基质的化学兼容性

1）样品中存在去污剂：含有离子型或非离子型去污剂（如SDS、Triton X-100、NP-40）的样品基质，常见于细胞或组织裂解液。这些物质会与考马斯亮蓝染料发生非特异性相互作用或导致其沉淀，从而干扰Bradford法的准确性。

选择：BCA对大多数去污剂表现出良好的耐受性，因此是此类样品的标准选择。

2）样品中存在还原剂：含有DTT（二硫苏糖醇）或β-巯基乙醇等还原剂的样品，常见于为维持蛋白活性或用于后续还原性SDS-PAGE的制备液。这些还原剂会直接将BCA反应体系中的Cu²⁺还原为Cu¹⁺，产生与蛋白质无关的强烈背景信号。

选择：Bradford染料结合原理不受还原剂影响，因此选择Bradford法。

3） 样品中同时存在去污剂和还原剂：此情况使两种常规方法均失效。理想策略是在添加还原剂之前，预留样品进行BCA定量。此外，也可以采用不受这些物质干扰的替代性定量技术（如660 nm蛋白定量法）。

2.3 匹配下游应用对数据精度的要求

1）高通量筛选和半定量估算：Bradford法

由于该方法反应快速（5-15分钟）、操作简便，具备高时效性，满足快速筛选的需求，但其较高的蛋白间差异性使其不适用于精确比较。其应用场景包括蛋白质纯化过程中对层析柱流出组分的快速检测；重组蛋白诱导表达条件的初步筛选及需要快速获得蛋白浓度大致范围等。

2）精确定量和发表级数据的：BCA法

该方法具有更低的蛋白间差异性、更宽的线性范围和更高的准确度，是确保下游实验结果可靠性和可重复性的基础，符合发表级数据的要求。应用场景如Western Blot实验中确保泳道间上样量的一致性；ELISA及其他免疫分析中抗原或抗体的准确定量和酶动力学研究中计算酶的比活力等。

3.1 BCA法注意事项

1）避免EDTA等螯合剂以及高浓度DTT、巯基乙醇等还原剂的干扰。

2）若样品中含有还原剂，需选择Bradford试剂盒。

3）注意试剂的保存条件，蛋白标准配制成溶液后应-20℃冻存。

4）若检测效果不佳，可以室温放置 2h 或 60℃放置 30min，颜色会随着时间的延长不断加深，显色反应也会随温度升高而加快；如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。

3.2 Bradford法注意事项

1）严格控制去垢剂浓度。例如，SDS应低于0.01%，Triton X-100低于0.1%。高浓度去垢剂会导致沉淀，干扰检测。

2）染料使用前需充分混匀，因存放时可能形成聚集体。

3）注意试剂的保存条件，蛋白标准配制成溶液后应-20℃冻存。

4）显色反应迅速，应在规定时间内完成检测。