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       收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

       常用的蛋白定量方法有:BCA法和Bradford法,其中BCA法比Bradford法灵敏度更高(BCA法灵敏度为0.5-20ug/mL,Bradford法灵敏度为1-20ug/mL),并且抗干扰能力更强,线性条件更好,所以一般推荐选用BCA法。

       BCA法原理:碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与二喹啉酸(BCA)形成紫色的络合物,吸光强度与蛋白浓度成正比。测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。

       Bradford法原理:考马斯亮蓝G-250和溶液中的蛋白质结合形成复合物,未结合的G-250有4种不同的离子形式,较蓝的阴离子和蛋白质结合,在595nm处有吸光度,测定其在595nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。